Plasmid- vs. genomische DNA-Extraktion für Superbeschäftigte. Bei der Plasmid-DNA-Extraktion muss das Plasmid von der genomischen DNA getrennt werden, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie alkalische Lyse, um Plasmide zu denaturieren und zu renaturieren, und mechanischen Aufschluss, um Zellen für die genomische DNA-Extraktion zu lysieren. Bei der Plasmidextraktion kommt eine größenbasierte Trennung zum Einsatz, während bei der genomischen DNA-Extraktion die Lyse und Reinigung mittels Ethanolfällung erfolgt.
Die meisten Experimente beginnen mit einem Stück DNA – entweder Plasmid-DNA oder genomischer DNA.
Um Plasmid-DNA zu isolieren, lysieren Sie Ihre Zellen und führen eine Minipräparation durch. Dabei achten Sie darauf, eine Kontamination der genomischen DNA zu vermeiden. Bei der genomischen DNA bricht man die Zellen auf andere Weise auf, um so viel wie möglich von ihrem Inhalt zu isolieren.
Was ist also der Unterschied in den Protokollen?
In diesem Artikel werden die Hauptunterschiede zwischen der Plasmid- und der genomischen DNA-Extraktion sowie die für beide gängigen Verfahren untersucht.
Genomische DNA-Extraktion
Lyse
Die Extraktion genomischer DNA (gDNA) ist einfacher, da eine starke Lyse der einzige Schritt ist, der erforderlich ist, um gDNA in Lösung freizusetzen. Bei Hefen, Pflanzen und Bakterien umfasst die Lyse das enzymatische Aufbrechen der starken, starren Zellwand, bevor die Plasmamembran mechanisch zerstört wird.
Zellwände sind normalerweise mit Lysozym, das Zellwandpeptidoglycane hydrolysiert, und der Serinprotease Proteinase K verdaulich. Bei bestimmten grampositiven Spezies unterstützt Lysostaphin die enzymatische Verdauung zusätzlich. Für exotischere Arten mit unterschiedlicher Zellwandzusammensetzung müssen Sie möglicherweise andere Enzyme verwenden.
Die mechanische Zerstörung der Zellwand stellt eine universellere Lysemethode für die gDNA-Extraktion dar. Das Perlenschlagen ist beliebt, und Sie können dies ganz einfach auf einem Wirbel mit 0,1 mm großen Glasperlen oder 0,15 mm feinen Granatperlen tun. Spezielle Vortex-Adapter helfen dabei, mehrere Extraktionen gleichzeitig und mit gleicher Effizienz durchzuführen. Das Schlagen der Perlen ist schneller als die enzymatische Lyse und im Allgemeinen gründlicher.
Bei zähen Fadenpilzen (z. B. Aspergillus Und Fusarium spp.) wird Zellmaterial oft in flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem Mörser gemahlen, gefolgt von schnellem Vortexen in Lösung mit einem geeigneten Lysepuffer.
Weitere Informationen zur Zelllyse finden Sie in unseren Artikeln, in denen gängige Lysemethoden und die Überlegungen erläutert werden, die Sie bei der Auswahl eines Zelllyseprotokolls berücksichtigen müssen.
Reinigung
Nach der Zelllyse (die die gDNA in Lösung bringt) muss nur noch die Probe gereinigt werden. Sie können die Phenol-Chloroform-Extraktion oder die Spinfilter-Membrantechnologie mit zugesetzten Guanidinsalzen verwenden, die die Bindung an Kieselsäure fördern.
Ein paar Ratschläge
Chromosomen brechen während der Reinigung, da sie zu groß sind, um intakt zu bleiben. Für die meisten Anwendungen stellt dies kein Problem dar. Tatsächlich kann der Bruch für PCR und qPCR von Vorteil sein, da er das Schmelzen der DNA unterstützt, was zu effizienteren Amplifikationsreaktionen führt.
Dies kann jedoch bei Anwendungen, die große DNA-Fragmente verwenden (z. B. Long-Read-Sequenzierung und Long-Range-Sequenzierung), ein ernstes Problem darstellen. Wenn Sie für diese Anwendungen ultralange DNA-Fragmente isolieren müssen, sollten Sie einen anderen Aufbau in Betracht ziehen.
Der E coli Das Chromosom ist etwas mehr als 4,5 MB groß, was etwa 0,005 Pikogramm pro Zelle entspricht. Eine typische Übernachtkultur aus einer einzelnen Startkolonie enthält etwa 1–2×109 Zellen/ml. Theoretisch bedeutet das, dass 1 ml Kultur etwa 5 µg gDNA ergeben sollte (vorausgesetzt, es sind ~10).9 Bakterienzellen). Berücksichtigen Sie dies bei der Berechnung, wie viel DNA Sie für die von Ihnen gewählte Anwendung benötigen.
Plasmid-DNA-Extraktion
Die Extraktion von Plasmid-DNA ist etwas schwieriger, da die Plasmid-DNA von der gDNA getrennt gehalten werden muss, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Diese Trennung basiert auf der Größe und eine gute Trennung hängt von der Verwendung der richtigen Lysemethode ab.
Lyse
Für die Plasmid-DNA-Extraktion muss die Lyse viel subtiler sein, als einfach die Zellwand mit Enzymen zu zerkauen oder mit Glasperlen einzuschlagen. Birnboim und Doly erfanden die (praktisch) universelle Methode zur Plasmid-DNA-Extraktion über alkalische Lyse im Jahr 1979.
Der Lysepuffer enthält Natriumhydroxid und SDS, die Plasmid und gDNA vollständig denaturieren (d. h. die DNA in Einzelstränge trennen). Es ist wichtig, dass dieser Schritt schnell durchgeführt wird, da eine übermäßige Denaturierung zu einem irreversibel denaturierten Plasmid führen kann.
Anschließend wird die Probe in einer Kaliumacetatlösung neutralisiert, um das Plasmid zu renaturieren. Dies ist der Schlüssel zur Trennung von Plasmid und gDNA. Da Plasmide klein sind, können sie sich leicht wieder verbinden und doppelsträngige DNA bilden. Genomische DNA ist jedoch zu lang, um sich vollständig wieder zu verbinden, und neigt stattdessen dazu, sich zu verheddern, sodass komplementäre Stränge getrennt bleiben.
Während der Zentrifugation bildet gDNA (an Protein gebunden) ein Pellet, während Plasmid-DNA löslich bleibt. Bei diesem Schritt ist es wichtig, die Probe nicht zu verwirbeln oder stark zu mischen, da die gDNA leicht bricht und die zerbrochene gDNA möglicherweise klein genug ist, um sich erneut zu verbinden und mit dem Plasmid in Lösung zu gehen.
Reinigung
Plasmid-DNA im Überstand kann dann mit Ethanol ausgefällt oder mit Phenol-Chloroform oder einem Spinfilter gereinigt werden. Wenn Sie die Spinfilter-Technologie verwenden, enthält der Neutralisationspuffer Guanidinsalze, sodass das Lysat das Silica direkt für das weitere Waschen und Eluieren binden kann. Die resultierende DNA ist rein genug für die meisten nachgelagerten molekularbiologischen Anwendungen. Weitere Informationen finden Sie in unserem Artikel, der erklärt, wie DNA-Extraktionskits funktionieren.
Wenn Sie das Plasmid für die Transfektion benötigen, ist die Anionenaustauschreinigung die bessere Wahl, um kontaminierendes Endotoxin zu entfernen. Die Entfernung von Endotoxinen ist auch mit schnelleren Reinigungsanlagen auf Kieselsäurebasis möglich.
Diese Methode ist mit Säugetier- und anderen eukaryontischen Plasmiden sowie anderen kleinen extrachromosomalen DNA-Spezies kompatibel. Bedenken Sie jedoch, dass die Kopienzahl von Plasmiden in Säugetierzellen und extranukleären Organellen von Pflanzen oft viel geringer ist.
Ein paar Ratschläge
Plasmid-DNA ist typischerweise 3–5 kb groß, abhängig von der Insertgröße. Der spezifische Replikationsursprung beeinflusst die Anzahl der Plasmidkopien pro Zelle. Ein typisches Plasmid mit hoher Kopienzahl wie pUC oder pBluescript sollte 4–5 µg DNA pro ml Kultur ergeben.
Um hohe Ausbeuten an Plasmid-DNA zu isolieren, verwenden Sie Kulturen in der späten Log-Phase oder der frühen stationären Phase. Bereiten Sie Kulturen mit frischen Einzelkolonien und frischen Selektionsantibiotika in der richtigen Konzentration für die Plasmiderhaltung vor. Es ist wichtig, Bakterienkulturen nicht zu stark zu vermehren, da dies zu einer gDNA-Kontamination im Plasmidextrakt führen kann.
Plasmid vs. genomische DNA-Extraktion zusammengefasst
Hoffentlich wurden dadurch die Hauptunterschiede zwischen Plasmid- und genomischer DNA-Extraktion geklärt. Heutzutage gibt es Kits für alles. Und obwohl sie das Leben einfacher machen, ist es wichtig, die grundlegende Chemie hinter ihren Anweisungen zu verstehen.
Wenn Ihnen dieser Artikel gefallen hat, der (hoffentlich) einige grundlegende Techniken der Biologie entmystifiziert, würde Ihnen vielleicht unser Podcast gefallen. Mentoren an Ihrer Seite. In jeder Episode wird ein gängiges Konzept oder eine Technik in der Biologieforschung erläutert, sodass Sie ein Experte für die Grundlagen werden, Ihren praktischen Wortschatz erweitern und neue Soft Skills erlernen können. Schauen Sie sich das unbedingt an.
Ursprünglich 2014 veröffentlicht, 2019 erneut veröffentlicht. Überarbeitet und aktualisiert im Juni 2023.
